3月2021年3月GydF4y2Ba
第62卷,问题3GydF4y2Ba
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生理学和药理学GydF4y2Ba | 2021年3月GydF4y2Ba
NCX 667,一种新型一氧化氮供体,可以降低兔子、狗和非人类灵长类动物的眼压,增强tgf β2诱导的HTM/HSC构建的流出GydF4y2Ba
作者隶属关系和票据GydF4y2Ba
  • 埃琳娜巴斯蒂亚GydF4y2Ba
    尼克斯研究所,米兰,意大利GydF4y2Ba
  • 卡罗尔·b环面GydF4y2Ba
    内布拉斯加州大学医疗中心,奥马哈,内布拉斯加州,美国GydF4y2Ba
  • Brambilla普GydF4y2Ba
    尼克斯研究所,米兰,意大利GydF4y2Ba
  • 科琳娜加利GydF4y2Ba
    尼克斯研究所,米兰,意大利GydF4y2Ba
  • 尼可莱塔尓米兰特GydF4y2Ba
    尼克斯研究所,米兰,意大利GydF4y2Ba
  • Michael V. W. BergaminiGydF4y2Ba
    北德克萨斯大学健康科学中心北德克萨斯眼科研究所,美国德克萨斯州沃斯堡GydF4y2Ba
  • Emanuela MasiniGydF4y2Ba
    Neurofarba,佛罗伦萨大学药理学系,意大利佛罗伦萨大学GydF4y2Ba
  • 西尔维亚SgambelloneGydF4y2Ba
    Neurofarba,佛罗伦萨大学药理学系,意大利佛罗伦萨大学GydF4y2Ba
  • andrea m.不当GydF4y2Ba
    Glauconicx Biosciences Inc.,纽约州奥尔巴尼,美国GydF4y2Ba
  • Feryan Ahmed.GydF4y2Ba
    Glauconicx Biosciences Inc.,纽约州奥尔巴尼,美国GydF4y2Ba
  • 凯伦y TorrejonGydF4y2Ba
    Glauconicx Biosciences Inc.,纽约州奥尔巴尼,美国GydF4y2Ba
  • Tomas Navratil.GydF4y2Ba
    Nicox眼科公司,达勒姆,北卡罗来纳州,美国GydF4y2Ba
  • Francesco ImpagnatielloGydF4y2Ba
    尼克斯研究所,米兰,意大利GydF4y2Ba
  • 通讯:埃琳娜巴斯蒂亚,尼克斯研究所,威斯托21,20091,意大利米兰布雷斯托;GydF4y2Babastia@inox.it.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
调查眼科与视觉科学GydF4y2Ba 3月2021年3月,Vol.62,17. Doi:GydF4y2Bahttps://doi.org/10.1167/iovs.62.3.17GydF4y2Ba
摘要GydF4y2Ba

目的GydF4y2Ba:GydF4y2BaNCX 667是一种具有异晶核心的新型一氧化氮(NO)供体,其特征在于眼性高血压和青光眼的动物模型中的IOP降低能力。生物工程的人小梁网/施米运河(HTM / HSC)构建体用于探索作用方式。GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba:GydF4y2Ba眼睛正常染色新西兰白(NZW)兔子(ONT-兔),自发性眼高血压着色素荷兰腰带兔(SOHT-兔子),高渗盐水(5%)诱导的瞬时眼高血压NZW兔(TOHT-兔),眼压正常使用Beagle Dogs(狗狗)和激光诱导的眼高血压猴子猴(OHT-monkeys)。将NCX 667或载体(30μL)滴入交叉,掩蔽的时装和眼压(IOP),在给药前(基线)和此后几个小时测量。用NCX 667在眼部给药后,在眼部组织中用于循环鸟蛋白单磷酸(CGMP)测定。转化生长因子-β2(TGFβ2)(2.5ng / ml,六天) - 处理HTM / HSC构建体www.10bet地址流出工具的变化。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba:GydF4y2Ba在所有使用的模型中,NCX 667均导致眼压显著下降,且呈剂量依赖性。1%时,ont -犬、soht -兔、toht -兔、ont -兔和oht -猴的最大眼压降低效果分别为−4.1±0.6、−12.2±2.7、−10.5±2.0、−5.3±0.8和−6.6±1.9 mmHg。在ont -rabbit中,NCX 667(1%)在房水(AH)中增加了cGMP,但在视网膜和虹膜/睫状体中没有。NCX 667浓度依赖性地增加tgf β2处理的HTM/HSC构建物的流出能力(流出能力,0.10±0.06和0.30±0.10µL/min/mmHg/mmGydF4y2Ba2GydF4y2Ba,分别用于vehicle-和ncx667处理的构建)。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba:GydF4y2Ba在一些动物模型中,NCX 667可以显著降低眼压。HTM/HSC构建的证据表明,IOP的降低可能是由no介导的常规流出通道的增加所致。其他机制,包括AH的产生和巩膜外静脉压力的变化,可能不排除在这个时候。GydF4y2Ba

青光眼包括一系列视神经病变,其特征是视网膜神经节细胞丧失和视力丧失。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba通常由幽默(AH)分泌和通过流出途径引流产生的不平衡而增加的内部压力(IOP)增加,仍然是这种疾病的主要危险因素。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba然而,即使IOP降至正常范围,疾病也可以继续进行,GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba在眼压和高血压条件下测试新的潜在治疗剂的重要性。GydF4y2Ba
青光眼患者的睫状体分泌通常保持正常;而小梁网/Schlemm管压力依赖性流出(传统通道)阻力增加导致AH引流受损,被认为是这些患者眼压升高的主要原因。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba因此,可以高效地提高常规流出能力的新型药理剂。GydF4y2Ba
大多数青光眼批准的药物可减少AH分泌(即β-嵌体或碳酸酐酶抑制剂,αGydF4y2Ba2GydF4y2Ba肾上腺素能激动剂)或通过u瓣弧流出途径(即,前列腺素类似物)增加αh流出,很少(netarsudil)直接靶向常规途径。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba 那GydF4y2Ba 6.GydF4y2Ba
融合证据表明,通过激活可溶性观陀螺环化酶(SGC)信号通路的一氧化氮(NO)降低了肌动酶收缩性和细胞粘附性。这反过来导致细胞形状的变化和小梁网格(TM)和Schlemm运河(SC)的内壁的弛豫,从而降低抗IOP的αh流出和减少。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba此外,NO可以通过抑制Na/K atp酶活性来降低嗜水气单胞菌的形成和眼压。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba 那GydF4y2Ba 9.GydF4y2Ba因此,在过去几年中已经研究了影响NO / SGC信号传导的各种药物,其中一些人被注册为人类用途作为IP降低剂,其他人仍然在临床开发中进行同一眼部条件。这些包括vyzulta(Latanoprostene Bunod眼科溶液,0.024%),是2017年食品和药物管理局首次批准的拉扎斯托斯特的无捐赠衍生物GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba目前,该药物已在阿根廷、加拿大、香港、墨西哥、哥伦比亚、台湾、乌克兰和美国等许多国家上市,NCX 470是一种双作用的可提供no的比马前列素衍生物,目前正处于III期临床开发阶段,用于降低眼压或青光眼。这两种化合物结合了前列腺素F2α类似物通过增强葡萄膜巩膜途径降低iop的作用机制GydF4y2Ba10.GydF4y2BaNO主要增加了TM/SC常规流出量。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaLatanoprostene bunnod和ncx470都是非常安全有效的降眼压药物;这些药物以1:1的比例释放活性,其中NO的量不能独立于前列腺素F2α类似物调节。同样,sGC直接激活剂也进入了临床开发阶段;MGV354可以有效降低临床前动物模型的眼压GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba但在人类测试时效果很差。GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba
NCX 667((S) - ((3R,3AR,6R,6R)-6-羟基己二呋喃[3,2-B] F​​uran-3-Y1)5,6-双(硝基氧基)己酸酯),一种新的化学实体GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba目前正在临床前开发中,作为一种治疗眼压增高和青光眼的降眼压药物。本文报道了NCX 667在兔(ont -rabbit)和Beagle犬(ONT-dogs)眼压正常模型以及荷兰带兔(荷兰带兔)眼压降低能力。瞬态眼高压(tOHT) nzw -兔和oht -猴模型]。此外,白化和色素物种被用来解决药物-黑色素相互作用引起的潜在差异。GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba所有这些模型都代表了从正常眼压到开角型青光眼和高眼压或药物介导的高眼压的不同病理条件。此外,我们还通过监测ont兔眼组织中cGMP的积累,探讨了NCX 667降低眼压的分子机制。www.10bet最后,我们利用三维(3D)人小梁网/人施莱姆管(HTM/HSC)共培养组织构建,探讨了NCX 667对传统流出道的影响。GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba尽管是体外模型,但HTM / HSC被证明是预测常规流出途径上化合物的调节活性,这使得能够在发育早期阶段直接在人体组织中解决新化合物的影响。www.10betGydF4y2Ba16.GydF4y2Ba 那GydF4y2Ba 17.GydF4y2Ba
方法GydF4y2Ba
NCX 667合成途径和物理化学性质GydF4y2Ba
NCX 667 ((S)-((3R,3aR,6R,6aR)-6-羟基六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-基)5,6-双(硝基氧)己酸酯)是一种浅黄色油,其合成方法如下GydF4y2Ba图1GydF4y2Ba被视为叔丁酯;然后用ad-mix-α向化合物B提交至对映选择性的二羟基化(步骤2,GydF4y2Ba图1GydF4y2Ba),得到5-(S)对映体(化合物C)GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba以乙酸酐为溶剂制备化合物D(步骤3,GydF4y2Ba图1GydF4y2Ba);通过脱保护t-丁基酯得到化合物E(步骤4,GydF4y2Ba图1GydF4y2Ba).与此同时,商业异腺苷(化合物F)的两个羟基中的一个被保护为四氢吡喃醚(步骤5,GydF4y2Ba图1GydF4y2Ba)化合物g;最后,通过偶联化合物E和化合物G获得化合物H;然后通过脱保护获得NCX 667,产率为10.7%(在Isomannide上计算)。GydF4y2Ba
图1。GydF4y2Ba
NCX 667的合成途径((s) - ((3r,3ar,6r,6ar,6ar)-6-羟基苯并呋喃[3,2-b]呋喃-3-基)5,6-双(硝基氧基)己酸盐)。最终产量为10.7%(计算Isomannide)。GydF4y2Ba
图1。GydF4y2Ba
NCX 667的合成途径((s) - ((3r,3ar,6r,6ar,6ar)-6-羟基苯并呋喃[3,2-b]呋喃-3-基)5,6-双(硝基氧基)己酸盐)。最终产量为10.7%(计算Isomannide)。GydF4y2Ba
体外研究GydF4y2Ba
3D HTM / HSC中的幽默流出GydF4y2Ba
Torrejon等人最初描述的方法。GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba随后进行了微小的修改。简单地说,从废弃的(角膜移植后)供体组织环中分离的原始htm被分离并在75厘米内镀上GydF4y2Ba2GydF4y2Ba细胞培养烧瓶,10%胎牛血清(FBS)(ATLAS生物,CO,USA),其改进的MEM(康宁Cellgro,Manassas,VA,USA),其中雷菊酸0.1mg / ml。类似地,HSC细胞在75厘米中镀GydF4y2Ba2GydF4y2Ba细胞培养瓶:10%优质胎牛血清(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA),在Dulbecco's改进的Eagle 's培养基(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)中添加青霉素(100单位/mL)、链霉素(0.1 mg/mL)和l -谷氨酰胺(0.292 mg/mL;并在含有5%二氧化碳的潮湿大气中保持在37°C。GydF4y2Ba
2010年SU-8(Microchem Corp.,Westborough,MA,美国)用于开发自由站立的仿生多孔组织,用作培养HTM细胞的支架。如先前使用标准光刻技术所描述的,制造支架。GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba为了构建3D-HTM/HSC结构,将单个微组装的SU-8支架放置在直径15mm的铝环上,放置在24孔板中,然后植入4万至5万个原代HTM细胞。一旦融合,HTM构建体被倒置,原代HSC细胞(40000个细胞/样本)在支架另一侧培养10天。3D-HTM/HSC构建物达到一致后,在转化生长因子- β2 (TGFβ2, 2.5 ng/mL, 6天以减少流出设施)治疗前,血清饥饿(1% FBS-Dulbecco 's修饰的Eagle's培养基)1天,然后进行灌注研究。GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba灌注介质沿顶端-基底方向灌注结构体。整个实验过程中温度保持在34°C。连续监测并记录压力。灌注后,根据单位表面积压力与流量斜率的反比计算结构的流出能力。GydF4y2Ba
在体内研究中GydF4y2Ba
在所有实验中,动物都按照ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明照顾和治疗。实验是按照各机构动物保护委员会批准的协议进行的,所有的努力都是为了限制动物的数量和减少动物的痛苦。在新西兰白兔(NZW)上进行的试验获得了意大利佛罗伦萨大学动物伦理与关爱委员会和意大利卫生部国家伦理委员会的批准(授权编号318/2018-PR)。这些步骤是在佛罗伦萨大学的实验室动物住房和实验中心进行的。非人类灵长类动物的研究得到了内布拉斯加州大学医学中心动物护理和使用委员会的批准,实验在这个设施中进行。对狗的研究得到了捷克共和国卫生部动物护理和使用机构委员会和动物保护委员会的批准。实验是在Meditox位于捷克科纳罗维兹Pod Zamken的s.r.o.设施中进行的。GydF4y2Ba
ncx667的合成如下GydF4y2Ba图1GydF4y2Ba.其他化学品从美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich购买,除非另有说明。GydF4y2Ba
眼压正常兔和自发性眼压高兔GydF4y2Ba
和之前的工作一样,GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba使用雄性NZW兔重量1.5至2.0公斤或年轻(年龄30-40周)使用较轻1.0至1.5千克的雄性荷兰带兔。动物用于单一的实验并通过过量的戊巴比妥(午氨酸;乙酰喹啉,Magnyvernois,法国)在每个实验期结束时处死。使用Applanation气动计(型号30经典; Reichert,Depe,Ny,USA)确定IOP。在给药之前进行测量(基线),并在几个时间点,由掩蔽的研究者此后。载体[磷酸盐缓冲液pH6.0,kolliphor el 5%,二甲基亚砜(DMSO)0.3%,苯氮铵(Bac)0.02%],并将活性物质浸入动物的结膜囊中,以30μl总计体积。IOP变化与载体和基线(ΔΔIOP)计算如下:(药物IOPGydF4y2BaTxGydF4y2Ba−药物眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba−(Veh IOP .GydF4y2BaTxGydF4y2Ba- VEL IOP.GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba)其中Iop.GydF4y2BaTxGydF4y2Ba和眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba分别为感兴趣时和基线时的眼压。GydF4y2Ba
眼压正常犬(ONT-Dogs)GydF4y2Ba
8只眼压正常的比格犬(男4只,女4只)。采用交叉试验设计,每只动物的眼睛按规定剂量随机给予赋形剂(30µL)或活性物质。在有意识的动物中,IOPs由蒙面研究者使用TonoVet (Icare Finland Oy, Finland)测定。在给药前和给药后30、60、120、240、480和1440分钟进行测量。计算soht -rabbit实验中相对于载药和基线(ΔΔIOP)的IOP变化。GydF4y2Ba
瞬时眼高血压兔模型(Toht-rabbits)GydF4y2Ba
先前描述的方法GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba之后进行了小的修改。将体重为1.5 ~ 2.0 kg的雄性NZW兔(N = 8/组)肌肉内注射氯胺酮(35 mg/kg)和甲苯噻嗪(5 mg/kg),并将50µL高渗盐水(5% NaCl水溶液)注射入双眼玻璃体。IOP用气压计测定(Model 30 Classic;Reichert),注射高渗盐水前(基础,时间0),以及30、60、90、180和240分钟后。在眼内注射高渗盐水后,立即以30 μL滴剂滴入结膜囊,以指定剂量滴入载体(磷酸盐缓冲液pH 6.0, Kolliphor EL 5%, DMSO 0.3%, BAC 0.02%)或NCX 667。动物恢复意识后,眼压由研究人员在指定的时间点进行监测。计算soht -rabbit实验中相对于载药和基线(ΔΔIOP)的IOP变化。GydF4y2Ba
非人类灵长类动物(oht -猴子)的激光诱导眼压增高GydF4y2Ba
如先前的工作所述进行实验。GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba选用8只10 ~ 22岁的雌性食蟹猴。所有患者均在数年前接受了单侧左眼TM激光治疗。IOP的测量由对治疗组进行蒙面的研究人员在单独的时段进行。采用随机盲法,每只动物的激光眼在第1天滴入30 μL的载药或药物。一周后,给药顺序被颠倒了。有意识的动物坐着,局部用盐酸丙哌卡因(0.13%)30 μL治疗。使用气压计进行眼压测定(30型经典;Reichert)连接到一个PowerLab转换器和一台笔记本电脑。只有在获得所有数据并完成评估后,才打破治疗代码。计算soht -rabbit实验中相对于载药和基线(ΔΔIOP)的IOP变化。GydF4y2Ba
环磷酸鸟苷(cGMP)在ONT-Rabbit眼组织中的定量www.10betGydF4y2Ba
在AH,虹膜睫状体(ICB)和视网膜(RE)中检测cGMP水平,如前所述。GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba简而言之,在治疗之前和载体或NCX 667(1%)给药后30和60分钟收集RES,ICB和AHS;所有动物都是预处理的(30分钟),具有亚阈值剂量(0.03%)YC-1,一种可溶性的瓜旺环酶刺激器,以增强信噪比。根据CGMP ELISA套件中规定的协议(CATALOG NUMBER KA3389; AFFOVA CORPORATION,CA,USA)进行处理。具体地,在PBS型-5抑制剂Avanafil(0.1μm终浓度)的存在下,在PBS缓冲液中均化ICBS和RE均化,并与95/5%的水/三氯酸酯混合。将匀浆在1500℃下离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba和48°C 10分钟以除去沉淀物。类似地,收集AH样品,加入Avanafil(终浓度为0.1μm终浓度),然后在5体积的95/5%水/ TCA中稀释。将上清液以水饱和乙醚萃取,在70℃下干燥5分钟,测定CGMP含量。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
体外药理学GydF4y2Ba
3D-HTM/HSC构建中房水流出的变化GydF4y2Ba
根据血流速率计算出生物工程3D-HTM/HSC的流出设施,并在灌注研究中收集压力数据。每组n≥4个个体灌注研究,数据以平均±SEM表示。所示GydF4y2Ba图2GydF4y2Ba,在这一系列实验中,TGFβ2刺激条件下的基础流出为0.08±0.04μL/ min / mmHg / mmGydF4y2Ba2GydF4y2Ba.NCX 667(1-100μm)导致流出机构达到0.31±0.10μl/ min / mmHg / mm的浓度依赖性增加GydF4y2Ba2GydF4y2Ba在测试的最高浓度下。GydF4y2Ba
图2。GydF4y2Ba
3D-HTM / HSC构建体中流出机构的浓度依赖性变化。生物工程3D-HTM / HSC模型的“流出工具”是从灌注研究期间收集的流量和压力数据计算的数学上计算。对于每个浓度,N = 4-6个单独的灌注研究,并且数据显示为平均值±SEM。使用单向分析进行分析样品之间的差异,然后进行Tukey检验。GydF4y2Ba
图2。GydF4y2Ba
3D-HTM / HSC构建体中流出机构的浓度依赖性变化。生物工程3D-HTM / HSC模型的“流出工具”是从灌注研究期间收集的流量和压力数据计算的数学上计算。对于每个浓度,N = 4-6个单独的灌注研究,并且数据显示为平均值±SEM。使用单向分析进行分析样品之间的差异,然后进行Tukey检验。GydF4y2Ba
在体内药理学中GydF4y2Ba
NCX 667介导的IOP降低眼压循环条件GydF4y2Ba
IOP降低效果在ont-rabbits中GydF4y2Ba
NCX 667首先在Ont-Rabbits中进行测试,以减少IOP的能力。具体地,NCX 667局部施用为0.1%至1%(n = 7-8)引发了IOP的剂量依赖性减少(GydF4y2Ba图3GydF4y2Ba).这些动物的基线眼压在组间无法区分。NCX 667暴露导致眼压迅速下降,在给药后0.5 - 1小时内达到最大值,无论使用的剂量(ΔΔIOPGydF4y2Ba60min.GydF4y2Ba分别为1%、0.3%和0.1%剂量后的−5.3±0.8、−4.6±1.0和−2.7±0.4 mmHg)。GydF4y2Ba
图3。GydF4y2Ba
ncx667对ont兔的降眼压作用。眼内压力(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)和与车辆的差异(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba滴注NCX 667(0.1%,N = 8; 0.3%,n = 8; 1%,n = 7)和相应的载体(磷酸盐缓冲液pH6.0,Kolliphor El 5%,DMSO 0.3%,Bac 0.02%,n = 5)以ont-兔确定。用气压计测定IOPs。每个时间点所报告的值是间隔1分钟进行两次连续测量并取平均值的结果。ΔΔIOP计算如下:(药物IOPGydF4y2BaTxGydF4y2Ba−药物眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba−(Veh IOP .GydF4y2BaTxGydF4y2Ba- VEL IOP.GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba)其中Iop.GydF4y2BaTxGydF4y2Ba和眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba分别为感兴趣时和基线时的眼压。数据报告为平均值±SEM。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05与相应的车辆组相比,GydF4y2BaT.GydF4y2Ba以及多个比较。GydF4y2Ba
图3。GydF4y2Ba
ncx667对ont兔的降眼压作用。眼内压力(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)和与车辆的差异(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba滴注NCX 667(0.1%,N = 8; 0.3%,n = 8; 1%,n = 7)和相应的载体(磷酸盐缓冲液pH6.0,Kolliphor El 5%,DMSO 0.3%,Bac 0.02%,n = 5)以ont-兔确定。用气压计测定IOPs。每个时间点所报告的值是间隔1分钟进行两次连续测量并取平均值的结果。ΔΔIOP计算如下:(药物IOPGydF4y2BaTxGydF4y2Ba−药物眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba−(Veh IOP .GydF4y2BaTxGydF4y2Ba- VEL IOP.GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba)其中Iop.GydF4y2BaTxGydF4y2Ba和眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba分别为感兴趣时和基线时的眼压。数据报告为平均值±SEM。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05与相应的车辆组相比,GydF4y2BaT.GydF4y2Ba以及多个比较。GydF4y2Ba
在平行研究中,为解决该化合物的脱敏和耐受性问题,将1%的剂量以每隔一小时或每天两次的时间反复给予兔子。多次给药一小时分开导致一个稳定的眼压下降持续了整个实验会话(ΔΔ眼压,−3.1±0.72−3.4±0.5−2.6±0.7−3.1±0.7毫米汞柱,一个,两个,三个,四个小时后剂量),这表明反应后不降低最初的挑战。同样,每天重复给药两次也会随着时间的推移产生类似的反应(ΔΔIOPGydF4y2Ba60min.GydF4y2Ba,分别为−3.6±1.0和−3.4±0.6 mmHg)。GydF4y2Ba
Iop-Dogs中的效果GydF4y2Ba
将NCX 667(1%和0.1% 30µL AM给药)在给药后30、60、120、240和480分钟的降眼压活性在ont -犬中进行了盲法交叉试验(N = 8;四男四女)。无论哪种组,基线IOP均无显著差异(载药组为16.1±0.5,17.4±0.4,17±0.4 mmHg,剂量分别为1%和0.1%)。与在ont -rabbit中观察到的相似,在ont -dog中,NCX 667引起了剂量依赖性的眼压下降,在给药后30 - 60分钟达到最大(ΔΔIOP)GydF4y2Ba30分钟GydF4y2Ba,−3.2±0.5和−2.4±0.6 mmHg,分别为1%和0.1% (GydF4y2Ba图4GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
图4。GydF4y2Ba
ONT-dogs的iop降低效果。眼内压(GydF4y2BaA、CGydF4y2Ba)从车辆和基线发生变化(GydF4y2BaB,DGydF4y2Ba在NCX 667(0.1%和1%)和相应的载体(磷酸盐缓冲液pH6.0,Kolliphor El 5%,DMSO 0.3%,BAC 0.02%)的滴管后(n = 8,四个女性和四个男性)。ΔΔIOP如下计算:(药物IOPGydF4y2BaTxGydF4y2Ba−药物眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba−(Veh IOP .GydF4y2BaTxGydF4y2Ba- VEL IOP.GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba)其中Iop.GydF4y2BaTxGydF4y2Ba和眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba分别为感兴趣时和基线时的眼压。数据报告为平均值±SEM。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05与相应的车辆组相比,GydF4y2BaT.GydF4y2Ba以及多个比较。GydF4y2Ba
图4。GydF4y2Ba
ONT-dogs的iop降低效果。眼内压(GydF4y2BaA、CGydF4y2Ba)从车辆和基线发生变化(GydF4y2BaB,DGydF4y2Ba在NCX 667(0.1%和1%)和相应的载体(磷酸盐缓冲液pH6.0,Kolliphor El 5%,DMSO 0.3%,BAC 0.02%)的滴管后(n = 8,四个女性和四个男性)。ΔΔIOP如下计算:(药物IOPGydF4y2BaTxGydF4y2Ba−药物眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba−(Veh IOP .GydF4y2BaTxGydF4y2Ba- VEL IOP.GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba)其中Iop.GydF4y2BaTxGydF4y2Ba和眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba分别为感兴趣时和基线时的眼压。数据报告为平均值±SEM。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05与相应的车辆组相比,GydF4y2BaT.GydF4y2Ba以及多个比较。GydF4y2Ba
图5。GydF4y2Ba
ncx677局部给药后眼组织cGMP的变化。www.10bet对NCX 667(1%)局部给药后的cGMP水平进行监测。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)或虹膜/睫状体和视网膜(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba)在指定的时间点处的ont-rabbits。数据报告为平均值±sem,n = 3只眼睛/时间点。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05相对于各自的车辆;双向方差分析,后跟Dunnett的多重比较测试。GydF4y2Ba
图5。GydF4y2Ba
ncx677局部给药后眼组织cGMP的变化。www.10bet对NCX 667(1%)局部给药后的cGMP水平进行监测。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)或虹膜/睫状体和视网膜(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba)在指定的时间点处的ont-rabbits。数据报告为平均值±sem,n = 3只眼睛/时间点。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05相对于各自的车辆;双向方差分析,后跟Dunnett的多重比较测试。GydF4y2Ba
ncx667介导的眼压降低GydF4y2Ba
sOHT-和toht -兔的iop降低效应GydF4y2Ba
年轻(年龄30-40周)Soht-Rabbits(n = 8 /组)已知具有高基础IOP,GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba首先用toht -家兔(N = 8/组)研究NCX 667在眼压条件下的降眼压作用,以及黑色素结合在NCX 667整体降眼压作用中的影响。在这一系列实验中,1% NCX 667在给药后的不同时间点与对照物进行比较。GydF4y2Ba
在年轻soht -兔中,载药组和治疗组的基线IOPs相似(载药组和NCX 667组分别为33.0±1.0和35.8±1.5 mmHg)。给药1小时后,1% NCX 667导致眼压显著下降(−26%),这在车辆治疗眼(GydF4y2Ba表格GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
表格GydF4y2Ba
NCX 667在眼压家兔和非人灵长类动物眼压降低中的作用GydF4y2Ba
表格GydF4y2Ba
NCX 667在眼压家兔和非人灵长类动物眼压降低中的作用GydF4y2Ba
NCX 667在眼压家兔和非人灵长类动物眼压降低中的作用GydF4y2Ba
50μL高渗(5%)盐水的玻璃体内施用导致瞬时IOP在30分钟内(34.4±0.7和34.8±2.1mmHg,分别在施用载体或NCX 667之前)。IOP在下半时间缓慢降低,注射盐水后300分钟达到基线值。暴露于1%NCX 667在整个实验期间显着减弱了盐水诱导的IOP上升。该效果在60分钟时最大程度地具有-10.5±2.0 mmHg的IOP差异与载体(GydF4y2Ba表格GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
激光诱导oht猴子的iop降低效应GydF4y2Ba
在晚期青光眼和高眼压的疾病模型中,为了研究AM给药NCX 667(1%, 30µL局部滴药)的降眼压活性,我们对8只高眼压的oht猴(雌性,N = 8)进行了疗效研究。测量数据记录在给药前(基线)以及给药后30、60、180、300、480和1440分钟。对照组和NCX 667组的基线IOP读数没有显著差异(对照组33.0±2.4 mmHg, NCX 667组33.4±3.0 mmHg)。GydF4y2Ba
在这些动物中,NCX 667在给药后30分钟开始逐渐有效,以在给药后30至60分钟的最大IOP活性达到最大的IOP活性(GydF4y2Ba表格GydF4y2Ba).在给药300分钟后,效果仍然明显,并在稍后的时间点恢复到基线值。GydF4y2Ba
NCX 667介导在ONT-Rabbits中单一眼时剂量后的CGMP形成GydF4y2Ba
CGMP的水平被确定为眼靶组织中没有释放的替代标记物。www.10bet在车辆治疗后的时间内检测到CGMP水平的几乎没有变化。有趣的是,CGMP在NCX 667(1%)给药后30分钟加倍(9.2±1.8和20.1±3.34 pmol / ml,载体和NCX 667)并继续在60分钟(9.4±1.3和24.7±2.0pmol/ ml,车辆和NCX 667分别为啊。相反,CGMP水平分别为0.78±0.12和0.31±0.01pmol / mg蛋白,在视网膜和虹膜/睫状体中,在NCX 667治疗后几乎保持不变(GydF4y2Ba图5GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
NCX 667,一种新的化学实体GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba包括锚定在异腺苷类核心上的双no释放部分,目前被认为可用于降低眼压和青光眼。这种化合物在室温黑暗条件下可以稳定保存数周,在冷藏条件下可以稳定保存两年(数据未显示);此外,ncx667在不同条件下的有效浓度下是可溶的,与外用眼科处方一致。在ont -rabbit和ont -dog中,当NCX 667的剂量在0.1%到1%之间时,可以快速有效地降低IOP。局部给药给某些释放no的分子,而不给其他的分子,显示会导致耐受性和快速反应,GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba这一特点将极大地阻碍这类分子在需要长期给药的疾病(如青光眼)中的潜在临床应用。ONT-rabbits重复管理一个小时除了一个完全有效剂量的NCX 667(1%)保留最初IOP-lowering效果,一样的重复管理复合每天好几天,这表明NCX 667不会导致急速免疫法在这些实验条件下和宽容。实际上,latanoprostene bunod (Vyzulta)是一种双作用的no -捐赠前列腺素,使用类似的no -基技术,在患者中每日给药12个月后,仍保持了降低iop的疗效。GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba
在Ont-兔中,NCX 667的眼部施用逐渐增加了CGMP的水平AH,而在其他眼部组织中没有观察到任何变化,包括虹膜/睫状体和视网膜,表明TM或SC SGC活动可以占所观察到的www.10betCGMP水平的变化均为啊。始终如一地,不知道不引出TM和SC放松。GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba此外,NCX 667减少了在TOHT-兔眼中玻璃体内注射高渗盐水引起的瞬时眼高度反应。当向SOHT-Rabbits施用NCX 667时,观察到类似的反应。类似于青光眼患者和IOP升高的结果,GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba与眼压沉变的条件(数据未显示的数据)相比,这些模型中的眼高血压伴随着眼部组织中的CGMP水平减少,表明NCX 667可以通过直接刺激这些动物中的SGC / CGMP信号传导途径www.10bet来降低IOP。GydF4y2Ba
然后,我们研究了NCX 667在Ont-Dogs和激光诱导的OCK-Monkeys中,一种已知的眼部高血压模型,用于响应NO信号级联的激活。GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba 那GydF4y2Ba 27.GydF4y2Ba在Ont-Dogs NCX 667逐渐和剂量依赖地降低IOP,以在给药后30至60分钟之间达到其最大效果。在OHT-Monkeys中,NCX 667在早晨给药后有效地控制了IOP,其具有在其他模型中观察到的时动词和与其他禁止捐赠的化合物报告的整体疗效相当GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba和ncx 470。GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba在所有测试条件下,剂量NCX 667没有导致可观的眼睛发红或眼部不适,如目视检查所评估,确认这一点,作为其他无捐赠的化合物,GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba是良好的耐受性。据报道,高浓度的一氧化氮会引起神经毒性。GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba尽管没有对NCX 667没有释放引起的潜在细胞毒性问题进行了具体的调查,但在以前的同样的经验中,视网膜损伤似乎不太可能发生在几个月内与患者局部给药的类似化合物;然而,需要额外的研究以更好地定义该化合物的安全性曲线。早期调查表明,不可能减少AH地层;GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba 那GydF4y2Ba 9.GydF4y2Ba然而,最近的研究表明,没有通过增加的传统流出设施主要降低IOP。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba 那GydF4y2Ba 30.GydF4y2Ba 那GydF4y2Ba 31.GydF4y2Ba用TGFβ2刺激的人类的生物工程HTM / HSC构建体已被证明是保留在体内发现HTM / HSC的所有生物学和生理特征的有效模型GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba;此外,该模型似乎具有许多与青光眼病理生理相关的特征,GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba使其特别是与在细胞水平下的其他途径中影响TM / SC生理学的研究化合物。在这里,我们提供了NCX 667以浓度依赖的方式增加了生物化HTM / HSC构建体中的TGFβ2诱导的流出设备,表明NO /可溶性观射环酶信号传导途径刺激促进TM和SC松弛可能是涉及的主要机制NCX 667的急性IOP降低活性。椎间静脉在常规流出途径的远端部分,其从TM开始。GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba因此,巩膜外静脉压力(EVP)在通过该通路的AH引流率和IOP控制方面起着重要作用。在本研究中,我们没有讨论NCX 667对EVP的影响;因此,目前不能完全排除EVP的变化;然而,考虑到NO在周围血管床上的明确作用,ncx667介导的IOP改变依赖于EVP修饰的可能性似乎不太可能,因为ncx667的应用应该引起了外膜血管的扩张,主要是小动脉的扩张。如其他NO供体所示,EVP和IOP随之增加。GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba同样,将动物暴露于非特异性NO合酶抑制剂L-NAME后,GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba血管收缩,EVP下降,IOP下降,进一步证实了NCX 667的整体作用缺乏这一特异性通路的参与。此外,NCX 667单次和重复给药后完全不充血证实了NCX 667介导的IOP效应是其对TM/SC流出的活性所致,而不是对可能伴有眼部充血的巩膜外血管的活性。GydF4y2Ba
如上所述,所示的替代途径由不包括αh生产。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba 那GydF4y2Ba 9.GydF4y2Ba睫毛机构缺乏CGMP的变化将争辩说,NCX 667几乎没有,如果有的话,对该途径的影响。GydF4y2Ba
总之,这些数据提供了功能性证据,表明NCX 667由于其供no能力降低了眼压,而不考虑基线眼压值和所使用的动物种类,这表明该化合物可能有助于治疗人类眼压正常和高血压情况。此外,我们的数据表明,该化合物的iop降低作用主要是通过增加常规流出设施来介导的。GydF4y2Ba
致谢GydF4y2Ba
作者感谢Angela Kothe和José Boyer的评论和建议,它们极大地改进了整个手稿。GydF4y2Ba
指出这项工作的资助信息没有收到任何资金。GydF4y2Ba
披露:GydF4y2BaE. Bastia,GydF4y2BaNicox (E);GydF4y2BaC.B. Toris,GydF4y2BaNicox (F);GydF4y2Bas . BrambillaGydF4y2BaNicox (E);GydF4y2BaC. Galli,GydF4y2BaNicox (E);GydF4y2BaN. Almirante,GydF4y2BaNicox (E);GydF4y2BaM.V.W. Bergamini,GydF4y2BaNicox(c);GydF4y2BaE. Masini,GydF4y2BaNicox (F);GydF4y2BaS. sgambellone,GydF4y2Ba(n);GydF4y2Ba是。勿识,GydF4y2Ba格拉纽康(e),GydF4y2BaF.艾哈迈德,GydF4y2Ba格兰康(e),尼克斯(F);GydF4y2BaK.Y.Torrejon,GydF4y2Ba格兰康(e),尼克斯(F);GydF4y2BaT. Navratil,GydF4y2Ba尼克斯,(e);GydF4y2Baf . ImpagnatielloGydF4y2BaNicox (E)GydF4y2Ba
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图1。GydF4y2Ba
NCX 667的合成途径((s) - ((3r,3ar,6r,6ar,6ar)-6-羟基苯并呋喃[3,2-b]呋喃-3-基)5,6-双(硝基氧基)己酸盐)。最终产量为10.7%(计算Isomannide)。GydF4y2Ba
图1。GydF4y2Ba
NCX 667的合成途径((s) - ((3r,3ar,6r,6ar,6ar)-6-羟基苯并呋喃[3,2-b]呋喃-3-基)5,6-双(硝基氧基)己酸盐)。最终产量为10.7%(计算Isomannide)。GydF4y2Ba
图2。GydF4y2Ba
3D-HTM / HSC构建体中流出机构的浓度依赖性变化。生物工程3D-HTM / HSC模型的“流出工具”是从灌注研究期间收集的流量和压力数据计算的数学上计算。对于每个浓度,N = 4-6个单独的灌注研究,并且数据显示为平均值±SEM。使用单向分析进行分析样品之间的差异,然后进行Tukey检验。GydF4y2Ba
图2。GydF4y2Ba
3D-HTM / HSC构建体中流出机构的浓度依赖性变化。生物工程3D-HTM / HSC模型的“流出工具”是从灌注研究期间收集的流量和压力数据计算的数学上计算。对于每个浓度,N = 4-6个单独的灌注研究,并且数据显示为平均值±SEM。使用单向分析进行分析样品之间的差异,然后进行Tukey检验。GydF4y2Ba
图3。GydF4y2Ba
ncx667对ont兔的降眼压作用。眼内压力(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)和与车辆的差异(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba滴注NCX 667(0.1%,N = 8; 0.3%,n = 8; 1%,n = 7)和相应的载体(磷酸盐缓冲液pH6.0,Kolliphor El 5%,DMSO 0.3%,Bac 0.02%,n = 5)以ont-兔确定。用气压计测定IOPs。每个时间点所报告的值是间隔1分钟进行两次连续测量并取平均值的结果。ΔΔIOP计算如下:(药物IOPGydF4y2BaTxGydF4y2Ba−药物眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba−(Veh IOP .GydF4y2BaTxGydF4y2Ba- VEL IOP.GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba)其中Iop.GydF4y2BaTxGydF4y2Ba和眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba分别为感兴趣时和基线时的眼压。数据报告为平均值±SEM。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05与相应的车辆组相比,GydF4y2BaT.GydF4y2Ba以及多个比较。GydF4y2Ba
图3。GydF4y2Ba
ncx667对ont兔的降眼压作用。眼内压力(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)和与车辆的差异(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba滴注NCX 667(0.1%,N = 8; 0.3%,n = 8; 1%,n = 7)和相应的载体(磷酸盐缓冲液pH6.0,Kolliphor El 5%,DMSO 0.3%,Bac 0.02%,n = 5)以ont-兔确定。用气压计测定IOPs。每个时间点所报告的值是间隔1分钟进行两次连续测量并取平均值的结果。ΔΔIOP计算如下:(药物IOPGydF4y2BaTxGydF4y2Ba−药物眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba−(Veh IOP .GydF4y2BaTxGydF4y2Ba- VEL IOP.GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba)其中Iop.GydF4y2BaTxGydF4y2Ba和眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba分别为感兴趣时和基线时的眼压。数据报告为平均值±SEM。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05与相应的车辆组相比,GydF4y2BaT.GydF4y2Ba以及多个比较。GydF4y2Ba
图4。GydF4y2Ba
ONT-dogs的iop降低效果。眼内压(GydF4y2BaA、CGydF4y2Ba)从车辆和基线发生变化(GydF4y2BaB,DGydF4y2Ba在NCX 667(0.1%和1%)和相应的载体(磷酸盐缓冲液pH6.0,Kolliphor El 5%,DMSO 0.3%,BAC 0.02%)的滴管后(n = 8,四个女性和四个男性)。ΔΔIOP如下计算:(药物IOPGydF4y2BaTxGydF4y2Ba−药物眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba−(Veh IOP .GydF4y2BaTxGydF4y2Ba- VEL IOP.GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba)其中Iop.GydF4y2BaTxGydF4y2Ba和眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba分别为感兴趣时和基线时的眼压。数据报告为平均值±SEM。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05与相应的车辆组相比,GydF4y2BaT.GydF4y2Ba以及多个比较。GydF4y2Ba
图4。GydF4y2Ba
ONT-dogs的iop降低效果。眼内压(GydF4y2BaA、CGydF4y2Ba)从车辆和基线发生变化(GydF4y2BaB,DGydF4y2Ba在NCX 667(0.1%和1%)和相应的载体(磷酸盐缓冲液pH6.0,Kolliphor El 5%,DMSO 0.3%,BAC 0.02%)的滴管后(n = 8,四个女性和四个男性)。ΔΔIOP如下计算:(药物IOPGydF4y2BaTxGydF4y2Ba−药物眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba−(Veh IOP .GydF4y2BaTxGydF4y2Ba- VEL IOP.GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba)其中Iop.GydF4y2BaTxGydF4y2Ba和眼压GydF4y2BaT0.GydF4y2Ba分别为感兴趣时和基线时的眼压。数据报告为平均值±SEM。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05与相应的车辆组相比,GydF4y2BaT.GydF4y2Ba以及多个比较。GydF4y2Ba
图5。GydF4y2Ba
ncx677局部给药后眼组织cGMP的变化。www.10bet对NCX 667(1%)局部给药后的cGMP水平进行监测。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)或虹膜/睫状体和视网膜(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba)在指定的时间点处的ont-rabbits。数据报告为平均值±sem,n = 3只眼睛/时间点。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05相对于各自的车辆;双向方差分析,后跟Dunnett的多重比较测试。GydF4y2Ba
图5。GydF4y2Ba
ncx677局部给药后眼组织cGMP的变化。www.10bet对NCX 667(1%)局部给药后的cGMP水平进行监测。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)或虹膜/睫状体和视网膜(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba)在指定的时间点处的ont-rabbits。数据报告为平均值±sem,n = 3只眼睛/时间点。GydF4y2Ba*GydF4y2Ba P.GydF4y2Ba< 0.05相对于各自的车辆;双向方差分析,后跟Dunnett的多重比较测试。GydF4y2Ba
表格GydF4y2Ba
NCX 667在眼压家兔和非人灵长类动物眼压降低中的作用GydF4y2Ba
表格GydF4y2Ba
NCX 667在眼压家兔和非人灵长类动物眼压降低中的作用GydF4y2Ba
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